Характеристика метода многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени

CC BY - Creative Commons Attribution 4.0 International

RAI : 20.500.11925/4932808

Год создания: 2021
Дата публикации в реестре: 20.06.2021
Дата последнего обновления: 20.06.2021



Правообладатели:

Николаева Александра


Описание:
В данной работе было проведено исследование по определению аналитических свойств метода разработанной многолокусной МЧ-кПЦР для количественного анализа уровня метилирования ДНК. Материалом для характеристики метода многолокусной МЧ-кПЦР служила ДНК из лимфоцитов периферической крови, выделенная с использованием высоких концентраций солей. Для определения аналитических свойств метода МЧ-кПЦР, считали, что ДНК, не обработанная метилчувствительной рестриктазой BstHHI (сайт узнавания GCG/C), является модельной метилированной матрицей (Me+, не гидролизованная) в то время, как гидролизованная ДНК – модельной неметилированной матрицей (Me-). Для моделирования уровня метилирования смешивали гидролизованную и негидролизованную ДНК в разных соотношениях. Последующую амплификацию генетического материала осуществляли методом МЧ-кПЦР с разработанной ранее многолокусной тест-системой, включающей 2 целевых локуса (PRKCB_2, GMDS_1) и внутренние контроли (положительный контроль PC6 и контроль полноты гидролиза DC10_TMEM158). Для определения уровня метилирования для каждого гена были получены значения ΔΔCy0 value и на основе этого посчитан уровень метилирования. Было выявлено, что для локуса PRKCB_2 модельный уровень метилирования прямо коррелирует с измеренным уровнем метилирования, локус GMDS_1 моноаллельно метилирован в ДНК из клеток крови здоровых доноров. В ходе исследования была определена эффективность ПЦР для каждого локуса тест-системы, которая варьирует в диапазоне 94–97%. По расчетным данным были определены аналитические свойства метода МЧ-кПЦР: Аналитическая чувствительность метода составила 10%. Относительная погрешность метода составила 11,38%. Таким образом, аналитическая чувствительность метода МЧ-кПЦР выше таковой метода прямого бисульфитного секвенирования по Сэнгеру (15–20%), но уступает таким методам, как Epytiper (5–7%), MS-HRM (5–10%), бисульфитное пиросеквенирование (5%). В отличие от методов, основанных на бисульфитной конверсии, пробоподготовка МЧ-кПЦР не приводит к деградации ДНК. Применение TaqMan-зондов позволяет мультиплексировать несколько целевых локусов в одной реакции, что является успешным решением проблемы малого количества биологического материала, позволяя увеличить количество технических повторов, а, следовательно, точность анализа, и может быть использован для определения уровня метилирования панелей генов в образцах, в которых для анализа доступно малое количество ДНК (биопсия опухоли).

Язык:
rus

Тематика:
Медицина и здравоохранение

Тип:
Дипломы

Банк знаний:
Научный корреспондент

Источник:
nauchkor.ru




Я - автор

Вы можете подать заявку на авторство данного произведения, привязать его к своему аккаунту и выбрать правовой режим его использования.



Добавить в избранное Предложить изменения


Отправить претензию

Поделиться c друзьями: